CD74 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400279-ACT

Humanes CD74 kodiert die Invariantkette (Ii), ein Typ‑II‑Transmembranprotein, das MHC‑Klasse‑II‑α/β‑Heterodimere im endoplasmatischen Retikulum chaperoniert, ihren Transport durch endosomale Kompartimente reguliert und proteolytisch verarbeitet wird, wodurch CLIP für die Peptidbeladung entsteht. Durch die Kontrolle der Antigenprozessierung und ‑präsentation beeinflusst CD74 die Aktivierung der adaptiven Immunantwort und das antigenspezifische Priming von T‑Zellen; zudem ist es über Interaktionen mit Oberflächenrezeptoren wie dem Makrophagen‑Migrationsinhibitionsfaktor (MIF) an der intrazellulären Signalübertragung in antigenpräsentierenden Zellen beteiligt. Die CD74‑Expression ist in B‑Zellen, dendritischen Zellen und anderen professionellen antigenpräsentierenden Zellen ausgeprägt und verknüpft es mit Signalwegen, die die endolysosomale Proteostase, die Immunüberwachung und Entzündungsreaktionen steuern. Eine fehlregulierte CD74‑Expression wird mit immunvermittelter Pathologie in Verbindung gebracht und wird häufig in Kontexten hämatologischer Malignome und des Tumormikromilieus untersucht, in denen Antigenpräsentation und Immunsignalgebung gestört sind.

CD74 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CD74-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CD74 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CD74-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CD74-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CD74-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CD74-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CD74-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CD74-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CD74-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.