CD71/TFRC/Transferrin Receptor Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400310-ACT

TFRC codifica CD71, il recettore della transferrina che media il legame ad alta affinità e l’endocitosi clatrina-dipendente della transferrina per veicolare il ferro alle cellule, sostenendo la sintesi dell’eme, la respirazione mitocondriale e la replicazione del DNA. Dopo l’acidificazione endosomiale e il rilascio del ferro, l’apo-transferrina e CD71 riciclano alla membrana plasmatica, collegando l’assorbimento del ferro al traffico di membrana e alle vie lisosomiali/endosomiali. L’espressione di TFRC è strettamente regolata da elementi responsivi al ferro e si integra con la segnalazione IRP/IRE, con i programmi proliferativi guidati da MYC e con reti responsivi all’ipossia che modulano la richiesta cellulare di ferro. Un’attività di TFRC e una gestione del ferro deregolate sono spesso studiate nel metabolismo tumorale, nell’attivazione delle cellule immunitarie, nella biologia legata all’anemia e nelle interazioni ospite–patogeno che dipendono dalla disponibilità di ferro.

CD71/TFRC/Transferrin Receptor Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TFRC senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CD71/TFRC/Transferrin Receptor Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TFRC nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TFRC, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CD71/TFRC/Transferrin Receptor. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TFRC nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CD71/TFRC/Transferrin Receptor nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CD71/TFRC/Transferrin Receptor nelle cellule tumorali con espressione di TFRC silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.