Plasmide CRISPR d'Activation (h) CCDC109B: sc-412415-ACT

MCUB (CCDC109B) code pour une sous-unité régulatrice du complexe uniporteur mitochondrial du calcium, qui module l’influx de Ca2+ à travers la membrane interne mitochondriale et contribue à ajuster la bioénergétique mitochondriale ainsi que la signalisation dépendante du Ca2+. En agissant comme régulateur négatif de l’activité du canal MCU, CCDC109B influence la phosphorylation oxydative, l’équilibre des espèces réactives de l’oxygène (ROS) et le couplage entre les transitoires cytosoliques de Ca2+ et le métabolisme mitochondrial. Une régulation altérée de l’uniporteur a été associée à une dérégulation des réponses cellulaires au stress et à un remodelage de la dynamique mitochondriale, des processus pertinents pour des phénotypes prolifératifs et neurodégénératifs. Dans les cellules humaines, MCUB/CCDC109B est donc étudié dans le contexte de l’homéostasie du Ca2+ mitochondrial, de la reprogrammation métabolique et des programmes transcriptionnels induits par le Ca2+.

CCDC109B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MCUB sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CCDC109B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MCUB dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MCUB, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CCDC109B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MCUB natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CCDC109B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CCDC109B dans les cellules tumorales présentant une expression de MCUB silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.