Plasmide CRISPR d'Activation (h) cathepsin H: sc-402601-ACT

CTSH code la cathepsine H, une protéase cystéine lysosomale présentant à la fois une activité endopeptidase et une activité aminopeptidase, contribuant au renouvellement des protéines intracellulaires et au processing des peptides. La cathepsine H participe à la protéolyse dépendante des lysosomes et s’inscrit dans les voies de trafic endo-lysosomal qui influencent la présentation des antigènes, le remodelage de la matrice extracellulaire et les réponses au stress cellulaire. Des altérations de l’expression ou de l’activité de CTSH ont été associées à une dérégulation des réseaux de protéases dans l’inflammation, la neurodégénérescence et des processus liés au cancer, où des changements de la fonction lysosomale peuvent affecter l’invasion, la survie et la signalisation immunitaire. Ainsi, CTSH est fréquemment étudié dans le contexte de la protéostasie, de la biologie du microenvironnement tumoral et de la régulation des voies centrées sur le lysosome.

cathepsin H Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CTSH sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

cathepsin H Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CTSH dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CTSH, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de cathepsin H. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CTSH natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de cathepsin H au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie cathepsin H dans les cellules tumorales présentant une expression de CTSH silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.