Plasmide CRISPR d'Activation (h) Carbonyl reductase 1: sc-402755-ACT

Le gène humain CBR1 code la carbonyl réductase 1, une oxydoréductase cytosolique dépendante du NADPH qui convertit un large éventail d’aldéhydes et de cétones réactifs en alcools moins réactifs. En métabolisant des carbonyles issus de la peroxydation des lipides et d’autres électrophiles, CBR1 contribue à l’homéostasie redox cellulaire, aux réponses au stress oxydatif et au métabolisme de composés carbonylés endogènes et xénobiotiques. Des altérations de l’activité de CBR1 ont été associées à des variations de la capacité de détoxification des carbonyles et à des déséquilibres redox observés dans la biologie des cancers, l’inflammation et les dysfonctions métaboliques, ce qui en fait une cible pertinente pour des études de voies impliquant les dommages oxydatifs et la signalisation adaptative au stress. Sa position enzymatique l’inscrit dans des réseaux plus larges de détoxification des aldéhydes et d’utilisation du NADPH, qui influencent la protéostasie et la survie cellulaire en condition de stress.

Carbonyl reductase 1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CBR1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Carbonyl reductase 1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CBR1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CBR1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Carbonyl reductase 1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CBR1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Carbonyl reductase 1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Carbonyl reductase 1 dans les cellules tumorales présentant une expression de CBR1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.