Plasmide CRISPR d'Activation (h) CAMK2A/CaMKII alpha: sc-400228-ACT

CAMK2A code la sous-unité alpha de la protéine kinase II dépendante du Ca2+/calmoduline (CaMKIIα), une kinase sérine/thréonine qui convertit les transitoires de calcium intracellulaire en une signalisation dépendante de la phosphorylation. Dans les neurones, CaMKIIα est fortement enrichie au niveau des densités postsynaptiques, où elle régule le cycle des vésicules synaptiques, le trafic des récepteurs AMPA et l’expression génique dépendante de l’activité qui sous-tend la plasticité synaptique, l’apprentissage et la mémoire. CAMK2A intègre des signaux amont issus de l’entrée de Ca2+ médiée par les récepteurs NMDA et s’inscrit à l’interface des programmes transcriptionnels associés à MAPK/ERK et à CREB. Une dérégulation de la signalisation de CaMKIIα a été impliquée dans des phénotypes neurodéveloppementaux et neuropsychiatriques, des processus neurodégénératifs et des voies de stress excitotoxique, ce qui en fait une cible largement utilisée pour des études mécanistiques de la fonction neuronale.

CAMK2A/CaMKII alpha Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CAMK2A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CAMK2A/CaMKII alpha Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CAMK2A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CAMK2A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CAMK2A/CaMKII alpha. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CAMK2A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CAMK2A/CaMKII alpha au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CAMK2A/CaMKII alpha dans les cellules tumorales présentant une expression de CAMK2A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.