Calregulin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400775-ACT

Il gene umano **CALR** codifica per la calreticulina, uno chaperone multifunzionale del reticolo endoplasmatico e una proteina legante Ca2+ ad alta capacità, che supporta il controllo di qualità del ripiegamento delle glicoproteine attraverso il ciclo calnexina/calreticulina e processi associati al RE. La calreticulina influenza l’omeostasi del calcio intracellulare, la segnalazione dello stress del RE e la presentazione dell’antigene contribuendo al caricamento dei peptidi su MHC di classe I, collegando la proteostasi a vie immuno-correlate. Al di là del RE, CALR è stato associato alla regolazione dell’adesione cellulare e della segnalazione tramite interazioni con integrine e altri complessi associati alla membrana. L’espressione e la funzione deregolate di CALR sono rilevanti in modelli di stress del RE, morte cellulare immunogenica e meccanismi associati alle neoplasie mieloidi, supportandone l’impiego in studi sulla proteostasi e sulla segnalazione infiammatoria.

Calregulin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CALR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Calregulin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CALR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CALR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Calregulin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CALR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Calregulin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Calregulin nelle cellule tumorali con espressione di CALR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.