Plasmide CRISPR d'Activation (h) Calpain 8: sc-402847-ACT

Le gène humain **CAPN8** code la calpaïne 8, une protéase à cystéine dépendante du calcium appartenant à la famille des calpaïnes, qui contribue de manière contextuelle à la protéolyse régulée et au renouvellement des protéines. En modulant le clivage de substrats sélectionnés, la calpaïne 8 peut influencer le remodelage du cytosquelette, le trafic membranaire et des événements de transduction du signal qui façonnent les réponses cellulaires au stress ainsi que les programmes de différenciation. Le processing médié par les calpaïnes s’articule avec les réseaux de signalisation calcique et les voies de protéostasie qui coordonnent l’adaptation aux signaux environnementaux. Une activité des calpaïnes dérégulée a été impliquée dans la pathobiologie inflammatoire et épithéliale, ce qui fait de **CAPN8** une cible utile pour des études mécanistiques de la régulation dépendante des protéases dans les cellules humaines.

Calpain 8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CAPN8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Calpain 8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CAPN8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CAPN8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Calpain 8. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CAPN8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Calpain 8 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Calpain 8 dans les cellules tumorales présentant une expression de CAPN8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.