Calpain 5 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403881-ACT

CAPN5 codifica a calpaína 5, uma protease cisteína dependente de cálcio implicada na proteólise regulada que molda a dinâmica do citoesqueleto, o tráfego de membranas e a transdução de sinais. A atividade das calpaínas pode influenciar vias ligadas à motilidade celular, adesão e respostas ao estresse por meio da clivagem limitada de proteínas estruturais e de sinalização. A disfunção da atividade proteásica das calpaínas tem sido associada a processos inflamatórios e neurodegenerativos, e variações em CAPN5 têm sido estudadas em relação a fenótipos de degeneração da retina. Assim, a modulação da expressão de CAPN5 é útil para dissecar eventos de remodelamento mediados por proteases e programas de sinalização responsivos ao cálcio em células humanas.

Calpain 5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CAPN5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Calpain 5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CAPN5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CAPN5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Calpain 5. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CAPN5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Calpain 5 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Calpain 5 em células tumorais com expressão de CAPN5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.