Calpain 10 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405032-ACT

CAPN10 kodiert Calpain 10, eine ubiquitär exprimierte, calciumabhängige Cysteinprotease, die eine begrenzte Proteolyse intrazellulärer Substrate moduliert und dadurch Proteinumsatz, Umbau des Zytoskeletts und Signaltransduktion reguliert. Die Aktivität von Calpain 10 beeinflusst die mitochondriale Homöostase, den Glukose- und Lipidstoffwechsel sowie stressresponsive Signalwege, indem sie zentrale metabolische und signalgebende Proteine proteolytisch kontrolliert. Genetische Varianten und eine veränderte CAPN10-Expression wurden mit metabolischen Phänotypen in Verbindung gebracht, darunter Insulinresistenz und eine erhöhte Anfälligkeit für Typ-2-Diabetes, was seine Relevanz für Studien zu endokriner und mitochondrialer Dysfunktion unterstreicht. In der biomedizinischen Forschung wird CAPN10 häufig im Hinblick auf seine Rolle in der zellulären Energiebereitstellung, der entzündungsassoziierten metabolischen Umprogrammierung und der gewebespezifischen Regulation von Proteasenetzwerken untersucht.

Calpain 10 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CAPN10-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Calpain 10 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CAPN10-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CAPN10-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Calpain 10-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CAPN10-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Calpain 10-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Calpain 10-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CAPN10-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.