CA IV CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404215-ACT

Das menschliche Gen **CA4** codiert die Carboanhydrase IV (CA IV), ein glycosylphosphatidylinositol-(GPI)-verankertes, extrazelluläres Metalloenzym, das die reversible Hydratisierung von CO₂ zu Bicarbonat und Protonen katalysiert. Durch die Beschleunigung der CO₂/HCO₃⁻-Umwandlung an der Zelloberfläche unterstützt CA IV die Säure-Basen-Homöostase, den epithelialen Ionentransport und die CO₂-Verarbeitung in Geweben wie Niere und Lunge und trägt zur pH-Regulation in Mikroumgebungen bei, die durch Stoffwechsel und Perfusion geprägt sind. Die CA4-Aktivität steht in Wechselwirkung mit Bicarbonat-Transportsystemen und pH-sensitiven Signalprozessen, die die Zellphysiologie beeinflussen, einschließlich der Modulation von Transporterfunktionen und der extrazellulären Pufferkapazität. Eine dysregulierte Carboanhydrase-Aktivität und eine veränderte pH-Kontrolle sind relevant für krankheitsassoziierte Phänotypen in der Nieren- und Lungenphysiologie sowie in Kontexten, in denen extrazelluläre Ansäuerung das Zellverhalten beeinflusst.

CA IV Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CA4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CA IV Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CA4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CA4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CA IV-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CA4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CA IV-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CA IV-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CA4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.