Plasmide CRISPR d'Activation (h) CA III: sc-403538-ACT

Le gène humain **CA3** code l’anhydrase carbonique III (CA III), une métalloenzyme cytosolique à zinc qui catalyse l’hydratation réversible du CO₂ en bicarbonate et protons, contribuant ainsi au tamponnement du pH intracellulaire et aux flux de carbone. CA III est fortement exprimée dans le muscle squelettique et d’autres tissus oxydatifs, où elle intervient dans l’homéostasie métabolique, l’équilibre rédox et les réponses au stress oxydatif via des résidus cystéine réactifs et la S‑glutathionylation. Des altérations de l’expression de CA3 ont été rapportées dans des contextes de physiologie musculaire et de remodelage métabolique, ce qui soutient son utilisation comme indicateur moléculaire dans des études sur les myopathies, le métabolisme énergétique et les programmes d’adaptation au stress. En tant que composante de la régulation acido‑basique médiée par les anhydrases carboniques, CA III constitue un point d’entrée pertinent pour explorer comment la dynamique du pH influence l’activité enzymatique, la protéostasie et la fitness cellulaire.

CA III Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CA3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CA III Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CA3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CA3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CA III. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CA3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CA III au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CA III dans les cellules tumorales présentant une expression de CA3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.