c-Kit CRISPR Activation Plasmid (m): sc-421289-ACT

Mouse-Kit kodiert c-Kit (CD117), eine Rezeptor-Tyrosinkinase vom Typ III, die den Stem-Cell-Factor bindet und so die Erhaltung hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen, die Entwicklung von Melanozyten sowie das Überleben von Keimzellen reguliert. Nach ligandeninduzierter Dimerisierung und Autophosphorylierung aktiviert c-Kit die Signalwege PI3K–AKT, RAS–MAPK, JAK–STAT und PLCγ, um Proliferation, Migration und Differenzierung zu steuern. Eine Fehlregulation der KIT-Signalgebung und veränderte c-Kit-Expression werden mit aberranter Mastzellbiologie und Modellen hämatologischer Malignome in Verbindung gebracht und sind Gegenstand intensiver Forschung in der Entwicklungsbiologie und Immunologie. Als Oberflächenrezeptor mit gut charakterisierten nachgeschalteten Signalwegen dient c-Kit in Maus-Systemen als gut handhabbarer Knotenpunkt, um Signalschwellen und Linienentscheidungen zu untersuchen.

c-Kit Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Kit-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

c-Kit Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Kit-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Kit-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen c-Kit-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Kit-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von c-Kit-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des c-Kit-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Kit-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.