BSPII Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421011-ACT

Il gene murino Ibsp codifica la sialoproteina ossea II (BSPII), una glicoproteina secreta, altamente fosforilata, appartenente alla famiglia SIBLING e arricchita nei tessuti mineralizzati, dove regola l’organizzazione della matrice extracellulare e la nucleazione dell’idrossiapatite. BSPII si lega alle integrine e al collagene e interagisce con programmi di adesione e migrazione cellulare che influenzano la differenziazione degli osteoblasti, l’attività degli osteoclasti e il rimodellamento osseo. L’espressione di Ibsp è comunemente utilizzata come marcatore di maturazione osteogenica e di mineralizzazione della matrice; la sua deregolazione è associata ad alterazioni dello sviluppo scheletrico e a processi patologici legati alla calcificazione, rilevanti per la ricerca sull’apparato muscoloscheletrico e sulle metastasi ossee. Queste funzioni collocano Ibsp all’intersezione tra segnalazione della matrice extracellulare, deposizione minerale e vie di meccanotrasduzione studiate nella biologia dell’osso.

BSPII Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ibsp senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BSPII Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ibsp nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ibsp, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BSPII. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ibsp nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BSPII nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BSPII nelle cellule tumorali con espressione di Ibsp silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.