BSPII CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402368-ACT

IBSP kodiert das Knochen-Sialoprotein II (BSPII), ein sezerniertes, stark saures Glykoprotein der extrazellulären Matrix, das in mineralisierten Geweben angereichert ist. BSPII bindet Hydroxylapatit und interagiert über ein RGD-Motiv mit Integrinen, wodurch Zelladhäsion und -migration sowie die Kommunikation zwischen Osteoblasten und Osteoklasten während der Knochenmatrixablagerung und des Remodelings unterstützt werden. Die IBSP-Expression wird durch osteogene Transkriptionsprogramme reguliert und trägt zu biomineralisationsassoziierten Prozessen bei, die sich mit Signalwegen der Fokalkontakte und der Organisation der extrazellulären Matrix überschneiden. Eine fehlregulierte IBSP/BSPII-Expression wurde mit verändertem Knochenumsatz in Verbindung gebracht und wird häufig als Marker in Studien zur Skelettentwicklung, Kalzifikation sowie zu Interaktionen zwischen Tumoren und dem Knochenmikromilieu verwendet.

BSPII Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen IBSP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BSPII Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des IBSP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der IBSP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BSPII-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native IBSP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BSPII-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BSPII-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem IBSP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.