BRWD1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-430062-ACT

Brwd1 kodiert das Mausprotein BRWD1 (Bromodomänen- und WD-Repeat-domänenhaltiges Protein), einen nukleären, chromatinassoziierten Faktor, der acetylierte Histone erkennt und die epigenetische Regulation der Transkription unterstützt. BRWD1 hat etablierte Funktionen in der Keimzellentwicklung und im Fortschreiten der Meiose und trägt zu linien- bzw. zelltypspezifischen Genexpressionsprogrammen in Immunzellen bei, einschließlich der B‑Zell-Differenzierung. Über seine Bromodomänen und WD-Repeats ist BRWD1 mit Chromatin-Remodeling, transkriptioneller Kontrolle und zellzykluskoordiniertem Genregulationsgeschehen verknüpft. Eine Fehlregulation von BRWD1-assoziierten Chromatinzuständen ist in Mausmodellen relevant für Studien zu Entwicklungsdefekten, Infertilitätsphänotypen und Auffälligkeiten des Immunsystems.

BRWD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Brwd1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BRWD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Brwd1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Brwd1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BRWD1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Brwd1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BRWD1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BRWD1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Brwd1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.