Plasmide CRISPR d'Activation (h) Brn-3a/BRN3A/POU4F1: sc-400322-ACT

POU4F1 (Brn-3a/BRN3A) code un facteur de transcription à domaine POU qui régule la spécification des lignages neuronaux, la survie et la différenciation terminale en contrôlant des programmes géniques impliqués dans le guidage axonal, la croissance des neurites et la transcription sensible au stress. Il est fortement associé au développement des neurones sensoriels et est fréquemment utilisé comme marqueur et comme moteur mécanistique dans les études des états cellulaires dérivés de la crête neurale et des neurones périphériques. Brn-3a s’insère dans des réseaux transcriptionnels qui modulent l’apoptose et le contrôle du cycle cellulaire via la régulation en aval de cibles pro-survie et liées à la différenciation. Une activité dérégulée de POU4F1 a été rapportée dans des contextes de dysfonctionnement neurodéveloppemental et de reprogrammation transcriptionnelle oncogénique, ce qui soutient son utilité pour étudier une régulation génique pertinente pour les maladies.

Brn-3a/BRN3A/POU4F1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de POU4F1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Brn-3a/BRN3A/POU4F1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus POU4F1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription POU4F1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Brn-3a/BRN3A/POU4F1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus POU4F1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Brn-3a/BRN3A/POU4F1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Brn-3a/BRN3A/POU4F1 dans les cellules tumorales présentant une expression de POU4F1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.