Brn-2/BRN2/POU3F2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400392-ACT

POU3F2 (BRN2/Brn-2) ist ein POU-Homeodomänen-Transkriptionsfaktor, der an Oktamer-Motive bindet, um Genprogramme zu steuern, die die Festlegung auf neuronale Linien, die neuronale Differenzierung und die Aufrechterhaltung der Zellidentität regulieren. Im sich entwickelnden und im adulten Nervensystem koordiniert BRN2 zusammen mit anderen neurogenen Regulatoren transkriptionelle Netzwerke, um den Chromatinzustand zu modulieren und eine kontextspezifische Expression neuronaler Marker zu fördern. Eine fehlregulierte POU3F2-Aktivität wurde mit veränderten Differenzierungszuständen und Linienplastizität bei Krebs sowie mit neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen in Verbindung gebracht, was es zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung der transkriptionellen Kontrolle des Zellschicksals macht. Seine nachgeschalteten Effekte überschneiden sich mit Signalwegen, die an Stammzell-Eigenschaften, Migration und stressadaptiver transkriptioneller Neuverdrahtung beteiligt sind.

Brn-2/BRN2/POU3F2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen POU3F2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Brn-2/BRN2/POU3F2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des POU3F2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der POU3F2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Brn-2/BRN2/POU3F2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native POU3F2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Brn-2/BRN2/POU3F2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Brn-2/BRN2/POU3F2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem POU3F2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.