Plásmido CRISPR de Activación (m) BRCA1: sc-419362-ACT

El Brca1 de ratón codifica la proteína supresora de tumores BRCA1, un regulador central de la estabilidad genómica que coordina la reparación de roturas de doble cadena del ADN, la protección de las horquillas de replicación y el control de los puntos de control del ciclo celular. BRCA1 participa en la recombinación homóloga mediante interacciones con socios como BARD1, PALB2 y RAD51, y modula la cromatina y la señalización por ubiquitina en los sitios de daño. En células de mamífero, BRCA1 integra las respuestas al daño del ADN dependientes de ATM/ATR con programas de transcripción y replicación para limitar la mutagénesis. La disrupción o la regulación alterada de las vías asociadas a BRCA1 se utiliza ampliamente como modelo para estudiar mecanismos de inestabilidad genómica, respuestas al estrés y defectos de reparación del ADN relevantes para el cáncer en investigación biomédica.

BRCA1 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Brca1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

BRCA1 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Brca1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Brca1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de BRCA1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Brca1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de BRCA1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía BRCA1 en células tumorales con expresión de Brca1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.