Plasmide CRISPR d'Activation (h) BI-1: sc-404349-ACT

TMBIM6 code pour BI-1, une protéine membranaire du réticulum endoplasmique qui inhibe l’apoptose en modulant l’homéostasie du calcium du RE et en atténuant la signalisation du stress du RE. BI-1 influence les voies de la réponse aux protéines mal conformées (UPR), notamment PERK–eIF2α et la signalisation médiée par IRE1, et peut moduler le stress oxydatif ainsi que le dialogue avec les mitochondries, déterminant la survie cellulaire en conditions de stress protéotoxique. Par ces fonctions, TMBIM6 est fréquemment étudié dans le cadre de l’adaptation cellulaire au stress chronique, avec des associations rapportées avec la survie des cellules tumorales, la vulnérabilité au stress liée aux processus neurodégénératifs et des réponses inflammatoires induites par une protéostasie perturbée.

BI-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TMBIM6 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

BI-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TMBIM6 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TMBIM6, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de BI-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TMBIM6 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de BI-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie BI-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de TMBIM6 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.