Bex4 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-436560-ACT

Maus Bex4 (brain expressed X-linked 4) kodiert ein kleines, überwiegend neuronal exprimiertes Protein, das mit entwicklungsabhängig regulierten Transkriptionsprogrammen und der neuronalen Differenzierung in Zusammenhang steht. Als Mitglied der BEX-Familie ist Bex4 mit Signal- und Stressantwort-Netzwerken verknüpft, die Zellüberleben und Linienfestlegung beeinflussen; dabei wurden kontextabhängige Interaktionen beschrieben, die neurotrophinassoziierte Signalwege modulieren. Die Expression ist im Gehirn und in anderen neuroektodermalen Kontexten angereichert, wodurch Bex4 ein geeigneter Ansatzpunkt für Untersuchungen zur neuronalen Reifung, Axon-/Dendritendynamik und aktivitätsabhängigen Genregulation ist. Fehlregulierte Expressionsmuster der BEX-Familie wurden mit neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen und krebsassoziierten Transkriptionszuständen in Verbindung gebracht, was mechanistische Forschung dazu stützt, wie Bex4 Zellzustandsübergänge moduliert.

Bex4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Bex4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Bex4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Bex4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Bex4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Bex4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Bex4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Bex4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Bex4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Bex4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.