Plásmido CRISPR de Activación (m) BECN1/Beclin-1: sc-425033-ACT

El gen Becn1 de ratón codifica BECN1/Beclin-1, un andamiaje central del complejo de fosfatidilinositol 3-quinasa de clase III que regula el inicio de la autofagia y la nucleación del autofagosoma. A través de interacciones con VPS34/PIK3C3, ATG14, UVRAG y proteínas de la familia BCL2, BECN1 coordina el flujo autofágico, el tráfico endolisosomal y las respuestas celulares al estrés por falta de nutrientes. La regulación de la proteostasis y del control de calidad de los orgánulos vinculada a BECN1 conecta esta vía con la neurodegeneración, la biología de las infecciones, el metabolismo de células tumorales y la señalización inflamatoria. Como regulador nodal de la autofagia, BECN1/Beclin-1 se estudia con frecuencia por sus efectos en vías de supervivencia, la homeostasis mitocondrial y programas transcripcionales de adaptación al estrés.

BECN1/Beclin-1 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Becn1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

BECN1/Beclin-1 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Becn1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Becn1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de BECN1/Beclin-1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Becn1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de BECN1/Beclin-1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía BECN1/Beclin-1 en células tumorales con expresión de Becn1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.