Plasmide CRISPR d'Activation (h) BAP31: sc-402421-ACT

BCAP31 code la protéine humaine BAP31, une chaperonne membranaire du réticulum endoplasmique (RE) à passages multiples, qui régule le trafic et le contrôle qualité des protéines membranaires nouvellement synthétisées. BAP31 participe au transport du RE vers l’appareil de Golgi et à la dégradation associée au RE (ERAD), reliant le flux de la voie sécrétoire à la signalisation de la réponse aux protéines mal repliées (unfolded protein response, UPR) et au maintien de la protéostasie. Elle intervient aussi dans l’apoptose et l’homéostasie du calcium au niveau des sites de contact RE–mitochondries, influençant la sensibilité cellulaire au stress. Un dérèglement de la fonction BCAP31/BAP31 a été impliqué dans des altérations de la gestion des protéines et des programmes de survie cellulaire pertinents dans des contextes neurodéveloppementaux et oncogéniques.

BAP31 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de BCAP31 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

BAP31 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus BCAP31 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription BCAP31, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de BAP31. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus BCAP31 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de BAP31 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie BAP31 dans les cellules tumorales présentant une expression de BCAP31 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.