ATP5J Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419251-ACT

Atp5j codifica ATP5J (noto anche come F6), una piccola subunità accessoria dell’ATP sintasi mitocondriale F1Fo (Complesso V) che supporta l’assemblaggio e l’accoppiamento efficiente del flusso di protoni alla produzione di ATP durante la fosforilazione ossidativa. Modulando la bioenergetica mitocondriale, ATP5J contribuisce al mantenimento dell’equilibrio cellulare ATP/ADP, del potenziale di membrana mitocondriale e della flessibilità metabolica al variare delle richieste energetiche. Alterazioni della funzione dell’ATP sintasi e della conseguente attività della catena respiratoria sono associate a fenotipi di disfunzione mitocondriale che colpiscono i tessuti ad alto fabbisogno energetico e si intrecciano con processi legati allo stress ossidativo e all’apoptosi. Nei modelli murini, la produzione mitocondriale di ATP modificata viene spesso sfruttata per studiare meccanismi rilevanti per la biologia delle malattie neuromuscolari, cardiache e metaboliche a livello delle vie mitocondriali.

ATP5J Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Atp5j senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ATP5J Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Atp5j nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Atp5j, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ATP5J. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Atp5j nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ATP5J nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ATP5J nelle cellule tumorali con espressione di Atp5j silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.