Plasmide CRISPR d'Activation (h) ATP13A3: sc-413173-ACT

ATP13A3 code une ATPase de type P5 principalement localisée aux membranes endolysosomales, où elle est supposée réguler l’homéostasie des polyamines et des cations et soutenir le trafic vésiculaire. En influençant la fonction lysosomale, la dynamique des lipides membranaires et des processus de transport dépendants des ions, ATP13A3 peut affecter le flux autophagie–lysosome, la maturation endosomale et les réponses cellulaires au stress. Dans la littérature, une expression altérée d’ATP13A3 a été associée à des phénotypes relevant de la biologie vasculaire et à des contextes de signalisation proliférative, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude de la fonction endothéliale, de la détoxification intracellulaire et de l’adaptation métabolique. Sa connectivité au sein des voies de contrôle qualité des organites et des mécanismes de transport en fait également un nœud utile pour étudier comment le dysfonctionnement lysosomal contribue à des états cellulaires complexes associés aux maladies.

ATP13A3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ATP13A3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ATP13A3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ATP13A3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ATP13A3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ATP13A3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ATP13A3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ATP13A3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ATP13A3 dans les cellules tumorales présentant une expression de ATP13A3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.