Plásmido CRISPR de Activación (h) ATP11B: sc-411692-ACT

ATP11B codifica una flippasa de fosfolípidos P4-ATPasa que ayuda a mantener la asimetría lipídica de la membrana plasmática y de las endomembranas al translocar aminofosfolípidos a través de las bicapas de manera dependiente de ATP. Mediante la regulación de la curvatura de la membrana y la composición de cada monocapa, ATP11B contribuye a la gemación de vesículas, el reciclaje endocítico y los procesos de tráfico asociados al Golgi que moldean la clasificación de proteínas y la polaridad celular. En la literatura, se ha vinculado la alteración del transporte de fosfolípidos y de la dinámica de membranas en la que participa ATP11B con cambios en fenotipos de transporte de fármacos y en respuestas al estrés en modelos de células tumorales, lo que respalda su estudio en mecanismos de quimiorresistencia y tráfico intracelular. Su actividad también se cruza con vías que controlan la homeostasis de membranas, la señalización de apoptosis vinculada al “scrambling” lipídico y la función de los orgánulos.

ATP11B El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ATP11B sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ATP11B El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ATP11B en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ATP11B, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ATP11B. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ATP11B y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ATP11B en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ATP11B en células tumorales con expresión de ATP11B silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.