Plásmido CRISPR de Activación (m) ATG7: sc-428805-ACT

Atg7 de ratón codifica ATG7, una enzima tipo E1 que cataliza reacciones de conjugación similares a la ubiquitinación, esenciales para la formación de autofagosomas. ATG7 activa ATG12 y proteínas de la familia LC3/Atg8 para impulsar la expansión del fagóforo, el secuestro de carga y el flujo autofágico, conectando la detección de nutrientes con el recambio lisosomal. Por su papel central en la macroautofagia, ATG7 influye en el control de calidad mitocondrial, la proteostasis y la señalización inmunitaria innata, y su desregulación se usa comúnmente para modelar fenotipos dependientes de la autofagia en neurodegeneración, estrés metabólico, biología de infecciones y adaptación celular relevante para el cáncer. En sistemas murinos, la alteración de Atg7 se aplica ampliamente para estudiar el crosstalk con la señalización mTOR/AMPK, las respuestas al estrés del RE y programas transcripcionales asociados a la inflamación.

ATG7 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Atg7 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ATG7 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Atg7 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Atg7, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ATG7. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Atg7 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ATG7 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ATG7 en células tumorales con expresión de Atg7 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.