Plasmide CRISPR d'Activation (m) ASM: sc-423033-ACT

Le gène murin *Smpd1* code la sphingomyélinase acide (ASM), une hydrolase lysosomale qui convertit la sphingomyéline en céramide et en phosphorylcholine, régulant ainsi le renouvellement des sphingolipides et le remodelage membranaire. La production de céramide dépendante de l’ASM influence la fonction endolysosomale, le dialogue entre autophagie et lysosome, ainsi que des voies de signalisation sensibles au stress, associées à l’inflammation et à la mort cellulaire. Une perturbation de l’activité de l’ASM dérègle l’homéostasie lipidique et favorise l’accumulation de sphingomyéline, une caractéristique des pathologies de surcharge lysosomale et d’altérations de la fonction de la myéline et des cellules immunitaires. En recherche biomédicale, *Smpd1*/ASM sert à étudier la biologie des lysosomes, la signalisation médiée par la céramide et les mécanismes reliant le métabolisme lipidique à la neurodégénérescence et au stress métabolique.

ASM Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Smpd1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ASM Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Smpd1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Smpd1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ASM. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Smpd1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ASM au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ASM dans les cellules tumorales présentant une expression de Smpd1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.