Plasmide CRISPR d'Activation (h) ASK 1: sc-400658-ACT

MAP3K5 code la kinase 1 régulée par les signaux d’apoptose (ASK1), une MAP3K sensible au stress qui intègre le stress oxydatif, le stress du réticulum endoplasmique, les flux de calcium et les signaux inflammatoires pour relayer la signalisation via les cascades MAPK JNK et p38. L’activité d’ASK1 est régulée par des interactions dépendantes de l’état rédox avec la thioredoxine et d’autres protéines d’échafaudage/adaptatrices, couplant la détection du stress en amont à la phosphorylation des MAP2K en aval et à des programmes transcriptionnels qui modèlent l’apoptose, la production de cytokines et les réponses immunitaires innées. Une signalisation ASK1 dérégulée a été impliquée dans des contextes de lésions cellulaires pertinents pour la neurodégénérescence, le stress cardiométabolique et l’inflammation chronique, où une sortie MAPK altérée peut influer sur la survie, le remodelage et l’expression de gènes inflammatoires. Comme ASK1 occupe un nœud clé reliant les signaux de stress aux voies effectrices des MAPK, elle est fréquemment étudiée pour son rôle dans le remaniement des réseaux de signalisation et les décisions de destinée cellulaire dépendantes du contexte.

ASK 1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MAP3K5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ASK 1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MAP3K5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MAP3K5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ASK 1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MAP3K5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ASK 1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ASK 1 dans les cellules tumorales présentant une expression de MAP3K5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.