ART1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419208-ACT

Mouse Art1 codifica l’ecto-ADP-ribosiltransferasi 1 (ART1), un enzima ancorato tramite glicosilfosfatidilinositolo (GPI) che catalizza la mono-ADP-ribosilazione di proteine extracellulari o di superficie cellulare utilizzando NAD+. Questa modifica post-traduzionale può regolare la segnalazione di recettori e integrine, l’adesione cellulare e la comunicazione tra cellule immunitarie all’interno di microambienti infiammatori. L’attività di ART1 è stata associata alla modulazione del traffico leucocitario e del rimodellamento tissutale, sostenendo la ricerca su disturbi infiammatori, autoimmunità e interazioni tra tumore e sistema immunitario. Lo studio di Art1 offre un modo per chiarire come l’ADP-ribosilazione extracellulare si integri con il metabolismo del NAD+ e con le reti di segnalazione delle proteine di superficie.

ART1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Art1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ART1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Art1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Art1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ART1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Art1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ART1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ART1 nelle cellule tumorali con espressione di Art1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.