Plásmido CRISPR de Activación (h) Arkadia: sc-403319-ACT

El RNF111 humano codifica Arkadia, una ligasa E3 de ubiquitina de tipo RING que modula la señalización de la superfamilia TGF-β al ubiquitinar componentes reguladores y ajustar la amplitud y la duración de la transcripción dependiente de SMAD. A través de la proteostasis mediada por ubiquitina, Arkadia influye en las salidas de señalización nuclear que gobiernan decisiones de destino celular, programas de diferenciación y el control del crecimiento dependiente del contexto. La actividad de RNF111 se cruza con vías que controlan la regulación transcripcional y el recambio de proteínas, lo que la hace relevante para estudios de biología del desarrollo y plasticidad celular. La desregulación de la señalización TGF-β/SMAD y las alteraciones en la dinámica de la vía de la ubiquitina vinculadas a RNF111 se han asociado con remodelación patológica y estados de señalización relacionados con tumores en múltiples sistemas modelo.

Arkadia El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RNF111 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Arkadia El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RNF111 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RNF111, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Arkadia. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RNF111 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Arkadia en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Arkadia en células tumorales con expresión de RNF111 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.