Plasmide CRISPR d'Activation (h) ARHGEF5: sc-409563-ACT

ARHGEF5 code un facteur d’échange de nucléotides guanyliques (GEF) de la famille Rho, qui active les GTPases de la famille Rho et relie les signaux provenant des récepteurs de surface cellulaire au remodelage du cytosquelette d’actine. En régulant des voies dépendantes de RhoA, ARHGEF5 influence l’adhérence cellulaire, la polarité et la motilité, et contribue à la dynamique des adhésions focales ainsi qu’à la formation de fibres de stress. Cet axe de signalisation s’interface avec des voies contrôlant la prolifération et la survie, faisant d’ARHGEF5 un nœud pertinent pour l’étude du contrôle du cytosquelette et de la transduction du signal. Des altérations de la régulation des GTPases Rho ont été associées à des phénotypes invasifs et à une organisation tissulaire aberrante, ce qui justifie l’étude d’ARHGEF5 dans des modèles de maladie pertinents où la migration et la croissance sont dérégulées.

ARHGEF5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ARHGEF5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ARHGEF5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ARHGEF5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ARHGEF5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ARHGEF5. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ARHGEF5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ARHGEF5 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ARHGEF5 dans les cellules tumorales présentant une expression de ARHGEF5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.