ARF3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402706-ACT

ADP-Ribosylierungsfaktor 3 (ARF3) ist eine kleine GTPase aus der ARF-Familie, die den Membrantransport reguliert, indem sie zwischen GDP- und GTP-gebundenen Zuständen wechselt und so Vesikelknospung, Rekrutierung von Hüllproteinen und den Phospholipidstoffwechsel steuert. ARF3 trägt zur Dynamik des Golgi- und endosomalen Transports bei und beeinflusst die Sortierung von Fracht, die Sekretion und das Rezeptor-Recycling, die wiederum Signaltransduktion und die Zusammensetzung der Zelloberfläche prägen. Durch seine Funktionen im intrazellulären Transport und in der Koordination des Zytoskeletts kann eine veränderte ARF3-Aktivität Prozesse wie Proliferation, Migration und Stressantworten beeinflussen. Eine Fehlregulation des ARF-vermittelten Traffickings wurde mit krankheitsrelevanten Phänotypen in Krebs- und neurologischen Kontexten in Verbindung gebracht, was ARF3 als mechanistischen Knotenpunkt für die Untersuchung gestörter zellulärer Logistik unterstützt.

ARF3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ARF3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ARF3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ARF3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ARF3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ARF3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ARF3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ARF3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ARF3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ARF3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.