Plasmide CRISPR d'Activation (m) APP/Amyloid Precursor Protein: sc-419170-ACT

L’App murin code l’APP (protéine précurseur de l’amyloïde), une glycoprotéine transmembranaire de type I qui subit une protéolyse régulée par les α-, β- et γ-sécrétases, générant des ectodomaines solubles et des peptides amyloïdogènes. L’APP participe au développement neuronal, au transport axonal, à l’organisation synaptique et à la signalisation dépendante de l’activité, avec des rôles supplémentaires dans l’adhésion cellulaire et le trafic endocytique. Par l’intermédiaire de son domaine intracellulaire et d’interactions avec des adaptateurs, l’APP relie la dynamique membranaire à la signalisation MAPK/ERK et aux réponses transcriptionnelles. Un traitement et un trafic de l’APP dysrégulés sont largement utilisés comme points d’entrée moléculaires pour modéliser, dans des systèmes murins, la neurodégénérescence associée à l’amyloïde et la neuropathologie apparentée.

APP/Amyloid Precursor Protein Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de App sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

APP/Amyloid Precursor Protein Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus App dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription App, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de APP/Amyloid Precursor Protein. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus App natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de APP/Amyloid Precursor Protein au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie APP/Amyloid Precursor Protein dans les cellules tumorales présentant une expression de App silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.