Plasmide CRISPR d'Activation (h) Aph-1: sc-403984-ACT

L’APH1A humain code Aph-1, une sous-unité d’échafaudage essentielle du complexe γ‑sécrétase, qui soutient l’assemblage et la stabilité de la protéase responsable du clivage intramembranaire de multiples protéines membranaires de type I. Par l’activité de la γ‑sécrétase, Aph‑1 contribue aux voies de protéolyse intramembranaire régulée, notamment au traitement des récepteurs NOTCH et de la protéine précurseur de l’amyloïde (APP), influençant ainsi les décisions de destinée cellulaire, les programmes de différenciation et la signalisation neuronale. Une perturbation de la composition ou de l’activité de la γ‑sécrétase est associée à une modification de la sortie de la voie Notch et du traitement amyloïdogène, reliant les mécanismes associés à APH1A à la biologie du cancer, à la neurodégénérescence et à des phénotypes du développement. L’expression d’APH1A et la stœchiométrie du complexe sont donc pertinentes pour les études sur l’assemblage de la protéase, le trafic membranaire et la transduction du signal dans les cellules humaines.

Aph-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de APH1A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Aph-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus APH1A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription APH1A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Aph-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus APH1A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Aph-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Aph-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de APH1A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.