Plásmido CRISPR de Activación (m) AP-3β: sc-419135-ACT

Ap3b1 codifica la subunidad beta del complejo adaptador de proteínas 3 (AP-3β), un componente clave del tráfico asociado a clatrina que clasifica la carga transmembrana desde los endosomas hacia los lisosomas y los orgánulos relacionados con lisosomas. En células de ratón, las vías dependientes de AP-3 sostienen la biogénesis regulada de vesículas, la localización de proteínas de membrana y la entrega de carga, procesos importantes para la homeostasis endolisosomal y para compartimentos secretores especializados. La alteración de la función del complejo AP-3 se asocia con defectos en el transporte intracelular y en la maduración de orgánulos, procesos que convergen con la biología de los gránulos de células inmunitarias y la proteostasis neuronal. Como resultado, Ap3b1 se estudia con frecuencia en modelos de disfunción del tráfico vesicular, de pigmentación y fenotipos asociados a gránulos, y de mecanismos neuroinmunes que involucran orgánulos relacionados con lisosomas.

AP-3β El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Ap3b1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

AP-3β El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Ap3b1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Ap3b1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de AP-3β. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Ap3b1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de AP-3β en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía AP-3β en células tumorales con expresión de Ap3b1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.