Plásmido CRISPR de Activación (m) ANO2: sc-433990-ACT

Ano2 codifica ANO2 (TMEM16B), un canal de cloruro activado por calcio que modula la excitabilidad de la membrana al acoplar señales intracelulares de Ca2+ al flujo de Cl−. En neuronas y epitelios sensoriales, ANO2 contribuye a la repolarización dependiente de la actividad, la amplificación de la señal y la adaptación de la frecuencia de disparo, vinculando la dinámica de Ca2+ con la homeostasis iónica y el procesamiento sináptico. Este canal participa en programas de transducción de estímulos relevantes para la olfacción y otras vías sensoriales, y la alteración de la función de ANO2 se ha investigado en contextos de hiperexcitabilidad neuronal y disfunción sensorial. Los modelos murinos de Ano2 respaldan estudios mecanísticos sobre cómo la conductancia aniónica activada por Ca2+ influye en la fisiología de los circuitos y la señalización celular.

ANO2 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Ano2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ANO2 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Ano2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Ano2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ANO2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Ano2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ANO2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ANO2 en células tumorales con expresión de Ano2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.