Plasmide CRISPR d'Activation (h) Annexin V: sc-400836-ACT

L’ANXA5 humain code l’annexine V, une protéine de liaison aux phospholipides dépendante du Ca2+ qui s’associe préférentiellement à la phosphatidylsérine des membranes cellulaires et réorganise les microdomaines membranaires. L’annexine V participe au trafic membranaire, à la signalisation dépendante des phospholipides et à la régulation des surfaces impliquées dans la coagulation ; elle est largement utilisée comme marqueur moléculaire de l’externalisation de la phosphatidylsérine au cours de l’apoptose. Par ses fonctions dans la dynamique membranaire régulée par le calcium, l’annexine V est liée à des processus tels que la fusion vésiculaire, les réponses au stress cellulaire et la signalisation inflammatoire. Une expression ou une localisation dérégulée d’ANXA5 a été étudiée dans des contextes tels que la biologie de la thrombose, des phénotypes auto-immuns et des programmes de survie des cellules tumorales, ce qui étaye son utilité en tant que nœud mécanistique dans les voies associées aux membranes.

Annexin V Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ANXA5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Annexin V Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ANXA5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ANXA5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Annexin V. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ANXA5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Annexin V au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Annexin V dans les cellules tumorales présentant une expression de ANXA5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.