Plásmido CRISPR de Activación (h) Aminoacylase-1: sc-408464-ACT

ACY1 codifica la aminoacilasa-1, una hidrolasa citosólica dependiente de zinc que cataliza la desacetilación de N-acil-L-aminoácidos para generar aminoácidos libres y acetato. Esta actividad favorece la recuperación de aminoácidos y el metabolismo del nitrógeno, y puede influir en los reservorios intracelulares de sustratos que se entrecruzan con vías metabólicas más amplias y con las rutas de proteostasis. La aminoacilasa-1 también está implicada en el procesamiento de derivados de aminoácidos acetilados que se originan durante el recambio de péptidos, lo que vincula su función con la homeostasis celular bajo estrés metabólico. Se han descrito alteraciones en la expresión de ACY1 en múltiples contextos patológicos, incluida la reprogramación metabólica asociada al cáncer y errores congénitos relacionados con el metabolismo de aminoácidos, lo que la convierte en un nodo útil para estudios mecanísticos.

Aminoacylase-1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ACY1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Aminoacylase-1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ACY1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ACY1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Aminoacylase-1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ACY1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Aminoacylase-1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Aminoacylase-1 en células tumorales con expresión de ACY1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.