Plásmido CRISPR de Activación (h) alpha Synuclein: sc-417273-ACT

SNCA codifica la alfa-sinucleína humana, una proteína presináptica implicada en el tráfico de vesículas sinápticas, la liberación de neurotransmisores y la regulación de la curvatura de la membrana mediante la unión a lípidos. Se asocia con la maquinaria de reciclaje de vesículas e influye en vías de proteostasis, incluidos los sistemas ubiquitina–proteasoma y autofagia-lisosoma que controlan el recambio y la agregación de proteínas. La expresión desregulada de SNCA o su mal plegamiento se relacionan con la vulnerabilidad neuronal y se han estudiado ampliamente en el contexto de la patología por cuerpos de Lewy y los mecanismos asociados a la enfermedad de Parkinson. Como modulador de la homeostasis sináptica y del tráfico intracelular, SNCA se utiliza con frecuencia para investigar respuestas al estrés, disfunción mitocondrial y señalización neuroinflamatoria en modelos celulares.

alpha Synuclein El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SNCA sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

alpha Synuclein El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SNCA en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SNCA, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de alpha Synuclein. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SNCA y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de alpha Synuclein en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía alpha Synuclein en células tumorales con expresión de SNCA silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.