Plasmide CRISPR d'Activation (h) AKAP 95: sc-403651-ACT

AKAP8 humain code la protéine d’ancrage de la protéine kinase A 95 (AKAP95), un échafaudage nucléaire qui organise spatialement la protéine kinase A et d’autres complexes régulateurs afin de coordonner la signalisation dépendante de la phosphorylation au niveau de la chromatine. AKAP95 participe au traitement de l’ARN et au contrôle transcriptionnel via des interactions avec des composants de la matrice nucléaire et des facteurs associés à l’épissage, reliant ainsi l’architecture nucléaire aux programmes d’expression génique. Elle a été impliquée dans la progression du cycle cellulaire et la régulation du génome, ce qui la rend pertinente pour l’étude des signalisations prolifératives et des réseaux transcriptionnels dérégulés observés dans le cancer et d’autres troubles liés à la croissance.

AKAP 95 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de AKAP8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

AKAP 95 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus AKAP8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription AKAP8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de AKAP 95. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus AKAP8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de AKAP 95 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie AKAP 95 dans les cellules tumorales présentant une expression de AKAP8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.