Plásmido CRISPR de Activación (h) AKAP 8L: sc-406003-ACT

AKAP8L (proteína de anclaje de la proteína quinasa A 8‑like) codifica una proteína nuclear de anclaje de la proteína quinasa A (PKA) que organiza espacialmente la señalización de AMPc/PKA al fijar la actividad quinasa a compartimentos subnucleares definidos. Mediante interacciones de andamiaje, AKAP8L se vincula con la regulación de procesos asociados a la cromatina, el metabolismo del ARN y la arquitectura nuclear dependiente del ciclo celular, coordinando eventos de fosforilación con programas transcripcionales. Se ha descrito una expresión alterada o una dependencia de AKAP8L en contextos de cáncer y respuesta al estrés, donde la reorganización de redes de anclaje de quinasas puede influir en la proliferación y la regulación del genoma. Como andamio de señalización nuclear, AKAP8L se estudia con frecuencia por su papel en integrar la señalización de PKA con el control transcripcional y las vías de procesamiento de ARN.

AKAP 8L El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de AKAP8L sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

AKAP 8L El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus AKAP8L en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional AKAP8L, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de AKAP 8L. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo AKAP8L y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de AKAP 8L en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía AKAP 8L en células tumorales con expresión de AKAP8L silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.