Plasmide CRISPR d'Activation (m2) AKAP 2: sc-419065-ACT-2

Le gène murin Akap2 code la protéine d’ancrage de l’A-kinase 2 (AKAP2), une protéine échafaudage qui organise spatialement la protéine kinase A (PKA) et les composants de signalisation associés afin de conférer des réponses à l’AMPc spécifiques des compartiments cellulaires. En recrutant la PKA vers des sites sous-cellulaires définis, AKAP2 module des réseaux de phosphorylation qui régulent la dynamique du cytosquelette, la polarité cellulaire, le trafic membranaire et des programmes transcriptionnels dépendant du contexte en aval de la signalisation par l’AMPc. La perturbation ou la régulation altérée des microdomaines de PKA ancrés par les AKAP est pertinente pour l’étude de la signalisation du développement, de l’excitabilité des neurones et des cardiomyocytes, ainsi que de mécanismes plus larges de dérégulation de la signalisation impliqués dans des phénotypes associés aux maladies. Les approches d’édition génétique d’Akap2 et de génomique fonctionnelle permettent d’explorer la compartimentalisation de la PKA, de cartographier les interfaces d’interaction protéine-protéine et de valider des readouts cellulaires dépendants des voies de signalisation dans des modèles murins et des systèmes cellulaires ingénierés.

AKAP 2 Le plasmide d'activation CRISPR (m2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Akap2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

AKAP 2 Le plasmide d'activation CRISPR (m2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Akap2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Akap2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de AKAP 2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Akap2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de AKAP 2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie AKAP 2 dans les cellules tumorales présentant une expression de Akap2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.