aggrecan Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400760-ACT

ACAN codifica o agrecano, um grande proteoglicano de sulfato de condroitina que é um dos principais componentes estruturais da matriz extracelular da cartilagem. O agrecano interage com o hialuronano e com a proteína de ligação para formar agregados de alto peso molecular que geram pressão osmótica de intumescimento e conferem resiliência ao suporte de carga na cartilagem articular, influenciando a mecanotransdução dos condrócitos e a homeostase da matriz. A expressão e a renovação de ACAN estão estreitamente acopladas à organização da matriz extracelular, à biossíntese de glicosaminoglicanos e à remodelação proteolítica por agrecanases, como membros da família ADAMTS. A síntese desregulada de agrecano ou sua clivagem acelerada está associada à degeneração da cartilagem e a alterações no desenvolvimento esquelético, tornando ACAN um gene-chave para o estudo da biologia dos condrócitos e do catabolismo da matriz.

aggrecan O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ACAN sem alterar a sequência de ADN subjacente.

aggrecan O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ACAN em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ACAN, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de aggrecan. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ACAN nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de aggrecan no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via aggrecan em células tumorais com expressão de ACAN silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.