ADAM28 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404031-ACT

ADAM28 codifica una metalloproteasi ancorata alla membrana della famiglia ADAM (a disintegrin and metalloprotease), che media lo shedding dell’ectodominio e le interazioni cellula–cellula o cellula–matrice tramite i suoi domini disintegrinico e proteasico. Regolando la disponibilità di recettori di superficie, molecole di adesione e mediatori solubili, ADAM28 influenza la segnalazione dipendente dalla proteolisi, il traffico dei leucociti e il rimodellamento tissutale. L’espressione di ADAM28 è stata studiata in contesti che coinvolgono il reclutamento di cellule infiammatorie e il rimodellamento del microambiente tumorale, in cui un’alterata attività proteasica può modificare le dinamiche di adesione e la risposta alle citochine. In quanto proteasi associata alla superficie, ADAM28 viene spesso analizzata in vie legate alla regolazione della matrice extracellulare, alla segnalazione immunitaria e a fenotipi migratori.

ADAM28 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ADAM28 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ADAM28 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ADAM28 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ADAM28, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ADAM28. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ADAM28 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ADAM28 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ADAM28 nelle cellule tumorali con espressione di ADAM28 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.