ADAM10 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400883-ACT

ADAM10 codifica una metalloproteasi ancorata alla membrana della famiglia ADAM (a disintegrin and metalloprotease) che funge da principale α-secretasi, responsabile dello shedding dell’ectodominio di numerose proteine di superficie cellulare. Processando substrati quali recettori/ligandi NOTCH, caderine, recettori delle citochine e la proteina precursore dell’amiloide, ADAM10 influenza le decisioni sul destino cellulare, l’adesione, la migrazione e la segnalazione infiammatoria in molteplici tessuti. La proteolisi mediata da ADAM10 modula la dinamica della segnalazione Notch e la disponibilità dei recettori di membrana, plasmando i programmi trascrizionali a valle e la comunicazione intercellulare. Un’attività di ADAM10 deregolata è stata associata a un rimodellamento patologico delle reti di segnalazione implicate nella neurodegenerazione, nella biologia del cancro e nella disregolazione immunitaria, rendendolo un bersaglio utile per studi meccanicistici sul controllo delle vie dipendenti da proteasi.

ADAM10 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ADAM10 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ADAM10 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ADAM10 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ADAM10, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ADAM10. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ADAM10 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ADAM10 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ADAM10 nelle cellule tumorali con espressione di ADAM10 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.