ACO2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404434-ACT

O ACO2 humano codifica a aconitase mitocondrial 2, uma enzima ferro–enxofre que catalisa a etapa de isomerização de citrato em isocitrato no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA), sustentando assim o metabolismo oxidativo e a produção de NADH para a geração de ATP pela respiração. Ao acoplar o fluxo de carbono ao equilíbrio redox mitocondrial, o ACO2 influencia o manejo de espécies reativas de oxigênio, a anaplerose e a adaptação metabólica à disponibilidade de nutrientes. Alterações na atividade do ACO2 têm sido associadas a fenótipos de disfunção mitocondrial e a respostas ao estresse bioenergético que se cruzam com neurodegeneração, miopatia e a reprogramação metabólica associada ao câncer. Como um nó central do metabolismo mitocondrial, o ACO2 é frequentemente estudado no contexto da sinalização de hipóxia, da capacidade de fosforilação oxidativa e da regulação, por metabólitos, de vias epigenéticas e de estresse.

ACO2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ACO2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ACO2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ACO2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ACO2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ACO2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ACO2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ACO2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ACO2 em células tumorais com expressão de ACO2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.