AATM Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403969-ACT

O GOT2 humano codifica a aspartato aminotransferase mitocondrial (AATM), uma enzima dependente de fosfato de piridoxal que catalisa a transaminação reversível entre glutamato/oxaloacetato e aspartato/α-cetoglutarato. A AATM é um componente central do shuttle malato–aspartato, acoplando o equilíbrio redox citosólico e mitocondrial ao transferir equivalentes redutores para a mitocôndria e sustentar a homeostase de NADH/NAD⁺. Por meio de seus papéis no metabolismo de aminoácidos, na anaplerose do ciclo do TCA (ciclo do ácido tricarboxílico) e no manejo do nitrogênio, o GOT2 influencia a bioenergética mitocondrial e a disponibilidade de aspartato necessária para a síntese de nucleotídeos. A desregulação de vias ligadas ao GOT2 tem sido associada a estados metabólicos alterados observados em células proliferativas e adaptadas ao estresse, tornando-o relevante para estudos de reprogramação metabólica e função mitocondrial.

AATM O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GOT2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

AATM O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GOT2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GOT2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de AATM. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GOT2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de AATM no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via AATM em células tumorais com expressão de GOT2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.