A20/TNFAIP3 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423436-ACT

Tnfaip3 kodiert A20/TNFAIP3, ein ubiquitinmodifizierendes Enzym, das entzündliche Signalübertragung dämpft, indem es die Aktivierung der NF-κB- und MAPK-Signalwege downstream von Rezeptoren wie TNFR, TLRs und IL-1R beendet. Durch koordiniertes Deubiquitinieren und Ubiquitin-Ligase-Aktivitäten moduliert A20 K63- und M1-verknüpfte Ubiquitinketten an Signalmolekülen wie RIPK1, TRAF6 und NEMO und beeinflusst so die Zytokinproduktion und die Immunhomöostase. In den Immun- und Stromakompartimenten der Maus ist eine veränderte A20-Funktion mit dysregulierten angeborenen und adaptiven Antworten, abweichender Zellüberlebensregulation und erhöhter Empfindlichkeit gegenüber entzündlichen Stimuli verbunden. Tnfaip3 wird daher breit in der Erforschung von Autoimmunität, chronischer Entzündung und kontextabhängiger Signalgebung im Tumormikromilieu untersucht.

A20/TNFAIP3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Tnfaip3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

A20/TNFAIP3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Tnfaip3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Tnfaip3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen A20/TNFAIP3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Tnfaip3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von A20/TNFAIP3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des A20/TNFAIP3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Tnfaip3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.