A1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-416421-ACT

Das humane Gen **BCL2A1** kodiert das antiapoptotische BCL-2-Familienprotein **A1**, einen Regulator der äußeren Mitochondrienmembran, der das Zellüberleben erhält, indem er BH3-only-Proteine sequestriert und die durch BAX/BAK vermittelte Permeabilisierung der äußeren Mitochondrienmembran begrenzt. A1 integriert Signale aus inflammatorischen und stressresponsiven Signalwegen, einschließlich NF-κB-abhängiger Transkriptionsprogramme, um Apoptose, Zellüberleben und die Homöostase von Immunzellen zu modulieren. Die Expression von **BCL2A1** ist in hämatopoetischen Zelllinien häufig induzierbar und kann während Aktivierung und Differenzierung die Empfindlichkeit gegenüber apoptotischen Signalen beeinflussen. Eine dysregulierte Aktivität und Expression von **BCL2A1** wurde mit veränderten Apoptoseschwellen und Überlebensphänotypen in der Krebsbiologie und in inflammatorischen Kontexten in Verbindung gebracht und unterstützt mechanistische Studien zur Kontrolle von Zellschicksalsentscheidungen.

A1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen BCL2A1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

A1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des BCL2A1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der BCL2A1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen A1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native BCL2A1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von A1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des A1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem BCL2A1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.